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原代细胞培养
慢病毒包装

时间:2018-06-14 浏览:1029次


慢病毒

慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种,它需要相对较长的孵育时间,所以称之为“慢”病毒,Lenti在拉丁文中就是慢的意思。它包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。其中研究最多的是HIV-1慢病毒。  

慢病毒载体(Lentivirus vector)是以慢病毒基因组为基础,由所需的目的基因取代部分基因构建而成。目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。与一般的逆转录病毒载体相比,慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而实现持久表达。在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,又很少引发机体免疫反应,能达到良好的基因治疗效果,具有广阔的应用前景。

慢病毒包装实验流程如下:

1.根据目的基因相关信息(序列,基因序列号等)获取目的基因;

2.根据客户要求选择对应载体;

3. 将目的基因构建到慢病毒载体获得含有目的基因的重组载体;

4. 测序鉴定重组质粒,高纯化(不含内毒素)提取的重组质粒;

5. 使用高纯提重组载体和慢病毒包装质粒共转染 293FT 细胞,进行病毒包装并收集上清液;

6. 通过超滤和超速离心浓缩和纯化病毒;

7. 使用病毒液感染 293T 细胞,药物筛选细胞,构建稳定表达细胞系。

慢病毒使用安全及注意事项

1.慢病毒相关实验请在生物安全柜内操作。如果使用超净台请不要打开风机。

2.慢病毒感染实验时,请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不用将身体的任何部位裸露在安全柜内。

3.操作病毒时尽量避免气雾或者飞溅。如果溅出,请立即用70%乙醇加1%SDS溶液擦拭干净。

4.如果需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用Parafilm膜封口后离心。

5.废弃的含有病毒的培养基或者病毒接触过的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液(1:20),浸泡一天后丢弃。

6.实验结束后请用肥皂清洗双手。

 


                               第二代慢病毒质粒                                                                                         第三代慢病毒质粒


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