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原代细胞培养
CRISPR/Cas9基因敲除

时间:2019-01-15 浏览:416次

CRISPR/Cas9基因敲除

CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中类和类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。

目前,来自StreptococcuspyogenesCRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNAtracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’),几乎可以在所有的基因中找到大量靶点,因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞,是目前最高效的基因组编辑系统。

通过基因工程手段对crRNAtracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNAsingleguideRNA。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力,但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行操作。

作为一种新的基因编辑技术,CRISPR/Cas9有以下特点和优势

1、靶向精确性更高。RNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配,Cas9才会对DNA进行剪切。

2、可实现对靶基因多个位点同时敲除。

3、实验周期短,最快仅需2个月,节省大量时间和成本。

4、无物种限制。




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