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原代细胞培养
transwell迁移/侵袭实验

时间:2019-01-15 浏览:735次

transwell迁移/侵袭实验


细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 


迁移实验(cell migration assay

实验步骤: 

1)所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育; 

2)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×105 /ml 

3)在下室(即24孔板底部)加入600800μl 10%血清的培养基,上室加入100150μl细胞悬液,继续在孵箱培养24小时; 

4)用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μl甲醇的孔中,室温固定30分钟; 

5)取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μl Giemsa染液的孔中,室温染色1530分钟;

6)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞;

7)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片; 

8)显微镜下取9个随机视野计数,统计结果

注意事项 

1)根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。常用的为8.0-μm孔径(如AGS细胞),如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径; 

2)根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well chamber接种细胞数约为2≈5×104/well,迁移时间12≈36小时; 

3)由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber,为了避免操作污染,每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板(Corning); 

4)如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/ml FNFibronectin),具体可查阅相关文献; 

5)细胞悬液加入膜中央,尽量保证液面水平; 

6)固定染色擦洗时动作小心,避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞,以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗,但要小心避免将膜戳破; 

7Chamber和膜上都无法标记,操作时应小心避免混淆实验组和对照组; 

8)充分晾干,避免残留水分导致镜下聚焦不一致。


细胞侵袭实验 cell invasion assay 

操作步骤 

1Matrigel4℃过夜融化; 

2)用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml,冰上操作; 

3)在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel37℃温育45小时使其干成胶状; 

4)后续步骤同迁移实验(1-8)。 

注意事项 

1Matrigel在过高或过低的温度均易凝固,因此操作所需枪头和离心管应提前在4℃预冷; 

2)铺胶时保证液面水平,胶的厚度均匀一致,切勿产生气泡; 

3)其他注意事项同迁移试验。


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