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原代细胞培养
免疫荧光(IF)

时间:2019-01-17 浏览:442次


免疫荧光(Immunofluorescence

免疫荧光是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

基本实验步骤:

1细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

2固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.

3通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

4封闭。使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min.

5一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次,每次冲洗5min.

6二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。

7封片及检测。滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。


      


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