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原代细胞培养
TUNEL

时间:2021-03-04 浏览:798次

TUNEL

一、原理与意义:

TUNELTdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况,其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRPhorse-radish peroxidase)的链霉亲和素streptavidin特异性结合,后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺(DAB)产生深棕色反应,特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3-OH形成,很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂

1、器材:光学显微镜及其成像系统、摇床、组化笔、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的移液器及枪头等。

2、试剂:试剂盒含TdT 2×Biotinylated标记的dUTP、标记streptavidinHRPSSC 20×Proteinase kDAB 20×DAB底物Buffer 20×H2O2 20×

3、自备试剂:

11×PBSpH 7.42.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4),115℃×15 min

20.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水,115 ℃×15 min

34%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS65 ℃水箱中3 h多,再放入4 ℃保存。

4DNase I buffer40 mM Tris-HCl pH 7.9+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2

5Proteinase K buffer100 mM Tris-HCl pH 8.0+50 mM EDTA

6DNase 1(原液1000 U/ml199DNase 1缓冲液稀释至10 U/ml);

7DAB工作液(临用前配制,5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS

820 μg/ml Proteinase K工作液(按1500稀释贮存液1 mg/ml)。

9)另外,双蒸水、无菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇(10095857050%)、苏木素。

三、实验步骤

1、脱蜡:用二甲苯浸洗5 min×2次;

2、水化:用梯度乙醇(100%×5 min100%×3 min95%×3 min85%×3 min70%×3 min50%×3 min);

3、浸洗:0.85%NaCl×5 min⇒PBS5 min

4、固定:浸入4%多聚甲醛15 min

5、浸洗:PBS 5 min×2次;

6、细胞通透:用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织1510~30min RT

7、浸洗:PBS5 min

8、固定:浸入4%多聚甲醛5 min

9、浸洗:PBS 5 min×2次;

10、平衡:加100 ul平衡液,湿盒平衡105~10min

11、制备TUNEL反应混合液:处理组用1ul rTdT+1ul生物素标记的dUTP+98 ul平衡液混匀;而阴性对照组不加rTdT,改为三蒸水;阳性对照组先加入100ul DNase 1 缓冲液孵育5 min,甩掉液体后再加100 ul DNase 110 U/ml)酶切10 min,用去离子水冲洗4次,PBS浸洗5 min,后面步骤从第10步开始。

12、标记反应:加100ul TUNEL反应混合液于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h

13、终止反应:浸入2×SSC 15 min

14、浸洗:PBS 5 min×3次;

15、封闭POD:浸入0.3%H2O2 15 min

16、浸洗:PBS 5 min×3次;

17、酶标反应:加100 ul streptavidin标记HRP(按1500 PBS稀释)30 min

18、浸洗:PBS 5 min×3次;

19DAB显色(避光):加100 ulDAB混合液(50 ulDAB+50 ulDAB底物缓冲液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水)10 min左右,镜下出现浅棕色背景时。

20、用去离子水冲洗几次;

21、用苏木素复染,3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水(50708595100100%1 min)、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。

22、加一滴PBS或甘油在视野下,用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小,胞膜完整但出现发泡现象,晚期出现凋亡小体,贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状/凋亡小体)。

四、注意事项

1、结果分析时注意:在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断,从而引起假阳性结果;而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全,以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应,进而产生假阴性结果。

2、初次检测细胞凋亡,最好设置阳性对照片。

3、血细胞含量高的组织,尽可能延长过氧化氢的灭活时间。

4、苏木素的复染时间需要摸索。

5、每片所加试剂可调整,一般30~100 ul不等,但也要防止液体挥发而干片,且反应均在放置湿盒内。

结果展示:




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