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原代细胞培养
双荧光素酶报告基因检测

时间:2021-03-04 浏览:908次

双荧光素酶报告基因检测

一、检测原理

全基因合成miR潜在结合位点上下游~500bpLncRNAcircRNAmRNA3UTR)野生形式WT及结合位点的突变形式Mut,克隆到psiCHECK-2多克隆位点处(1640-1674)(图1),然后与miRmimics/NC共同转染293T细胞测定荧光素酶读值即可。


二、载体构建与Mimics合成

1、构建WT miR潜在结合位点到psiCHECK-2载体,命名为WT

2、构建Mut miR潜在结合位点到psiCHECK-2载体,命名为Mut(突变模式:A/TG/C互变);

3合成待测miRMimmics及阴性对照NC

三、 实验分组信息

psiCHECK- Target 序列

miR

Target-1

1

WT

NC

2

WT

Mimics

3

Mut

NC

4

Mut

Mimics

Target-2

1

WT

NC

2

WT

Mimics

3

Mut

NC

4

Mut

Mimics

四、具体实验步骤:

(细胞转染操作步骤

1事先准备好用于转染的分到96孔板中的293T 细胞和目的质粒,待细胞密度达到50%-70%为宜。

210 ml DMEM0.16 mglncRNA (circRNA/3’UTR)/Mut目的质粒以及5 pmolmiR/Negative.ControlN.CMimics充分混匀后室温放置(溶液A);然后将10 ml DMEM0.3 ml 的转染试剂(转染试剂为汉恒生物产品LipoFiter,浓度为0.8 mg/ml)充分混匀(溶液B),室温放置5 min

3将溶液A与溶液B充分混匀,室温放置20 min

4转染前为细胞换取新鲜培养基,之后将转染混合物加入混匀。37℃5% CO2培养。

5转染6 h后换取新鲜培养基,转染48 h后收集细胞检测。

(检测实验操作步骤

检测试剂盒:Promega Dual-Luciferase system

1、将5´PLB (Passive Lysis Buffer)用蒸馏水稀释至1´PLB,以96孔板每孔100 ml的量加入,用移液枪吹打打散细胞,置于室温摇床上缓慢摇15分钟后,将细胞裂解液吸至1.5 ml离心管,412000 rpm 13200g)离心10 min,取上清移入新的管子;

296孔板中加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II)( Luciferase Assay Reagent, Progema)工作液100 ml

3、加入20 ml细胞裂解液,移液枪吹打混匀2-3次,测定记录Firefly luciferase值,此值为内参值。

4、加入100 ml Stop & Glo® Reagent(Luciferase Assay Reagent, Progema),移液枪吹打混匀2-3次,测定记录Renilla luciferase值,此即为报告基因发光值。

五、 预期实验结果




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