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原代细胞培养
焦磷酸测序

时间:2021-03-05 浏览:866次

焦磷酸测序(Pyrosequencing)

焦磷酸测序技术是由4种酶(DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase))催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。

实验方法

1.甲基化处理

使用Qiagen EpiTect Bisulfite Kit试剂盒
步骤一:亚硫酸盐处理DNA
1.解冻DNA,Bisulfite Mix用800μl  Rnase-Free水稀释,旋涡震荡,直到所有的Bisulfite Mix完全溶解(存放时间-20℃,4周)。如果需要可以加热溶液到60℃,而后震荡混匀;不要将已经溶解的Bisulfite Mix放在冰上。
2.用PCR管,准备经行亚硫酸盐反应,将DNA用Rnase-free水定容至20μl。反应体系如下:
DNA:               20μl
Bisulfite Mix:         85μl
DNA Protect Buffer:    35μl
Total:               140μl

3.在常温下,彻底混匀反应混合液,溶液会在DNA Protect Buffer加入后由绿色变成蓝色。
4.使用PCR仪经行眼硫酸盐反应(约5h)。反应程序如下:
95℃  5min→60℃  25min→95℃  5min→60℃  85min→95℃  5min→60℃  175min→20℃ Forever
步骤二:洗涤甲基化后DNA
1.使用掌上离心机离心PCR管,将反应后的溶液转入新的1.5ml离心管中。
2.向1.5ml离心管中加560μl现配的含有10μg/ml carrier的Buffer BL。旋涡混匀混合液后,离心。
3.将EpiTect Spin Colums吸附柱放在收集管上,将上一步所有的混合液体倒入EpiTect Spin Colums吸附柱中,最高速离心1min(12000rpm  1min),倒掉废液。
4.小心打开盖子,加入500µl  Buffer BW ,最高速离心1min(12000rpm  1min),倒掉废液。
5.小心打开盖子,加入500µl  Buffer BD ,盖上吸附柱盖子,常温放置15min,
(注意 :勿将结晶倒入吸附柱;使用完BD后马上盖上盖子,避免长期暴露在空气中。)
6.最高速离心1min(12000rpm  1min),倒掉废液。
7.小心打开盖子,加入500µl  Buffer BW ,最高速离心1min(12000rpm  1min),倒掉废液。
8.重复上一步。
9.将吸附柱套在一个新的2ml收集管中,最高速空管离心1min(12000rpm  1min)。
10.将EpiTect Spin Colums吸附柱置于新的1.5mL离心管中,打开盖子,56℃,孵育5min。
11.将EpiTect Spin Colums吸附柱置于新的1.5mL离心管中,在吸附柱中心加入20µl  Buffer EB,15000×g  1min(12000rpm  1min);再向吸附柱中加入20µl  Buffer EB,15000×g  1min(12000rpm  1min)。

2.PCR
1引物设计: 所用软件:PyroMark Assay Design 2.0(具体见Primer.xlsx)
2引物合成方法:由上海祥音生物科技合成
3 PCR用到的试剂:KAPA2G Fast Multiplex Mix (Code NO.:KM5802)。
4 PCR的操作步骤:
PCR扩增体系:
KAPA2G Fast Multiplex Mix 12.5μL
Forward primer (10 Μm) 1μL
Reverse primer (10 Μm) 1μL
Template DNA 1μL
ddH2O 9.5μL
Total 25μL
PCR扩增程序
94 ℃ 5 min
94 ℃ 30 sec
56 ℃ 30 sec
72 ℃ 1min
72℃ 5 min
12℃ forever

3.Pyrosequencing检测
1. 在96孔PCR反应板中加入反应结合珠2 ul,结合缓冲液38ul,PCR产物40ul,室温下充分混匀10min。
2. 开启真空泵吸取结合珠及PCR产物混悬液,依次浸入70% 乙醇,0.2M NaOH和冲洗缓冲液中各5 S;
3. 关闭真空泵,后将探头上结合珠及PCR产物置人40ul退火缓冲液(含测序引物1.5 ul),85℃变性2 min,冷却至室温,使引物与模板退火杂交。
4. 根据Pyrose quencing软件序列设计信息所计算出剂量,在试剂舱中依次加入底物混合物、酶混合物及四种dNTP(QIAGEN),
5. 将试剂舱及96孔反应板放入Pyrosequencing检测仪(PyroMark Q96 ID,QIAGEN)进行反应,Pyro Q—CpG软件自动分析每个位点甲基化状态。

6. 样品编号为原始编号。



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