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原代细胞培养
PCR

时间:2021-03-05 浏览:966次

PCR

一、实验原理

PCR 全称聚合酶链式反应(英文:Polymerase chain reaction),是利用DNA双链复制的原理,在生物体外大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术,其特点是可以以微量的DNA为模板,快速扩增得到大量拷贝。原理是基于DNA 半保留复制与碱基互补配对原则,是在体外模拟DNA的天然复制过程,主要由‘变性-退火-延伸’这三个基本步骤构成,变性:DNA双链在高温条件(95℃)下解旋形成单链;退火:降低温度可使引物结合到单链DNA上,DNA聚合酶结合到引物上;延伸:DNA 聚合酶在其最适反应温度(72℃)开始沿着DNA5'-3' 方向合成互补链。随着PCR 的进行,生成的DNA本身将作为模板,从而启动链式反应,原始DNA模板被指数扩增。

 二、实验试剂

Taq酶,M-MLV逆转录酶,dNTPsDEPC处理水,双蒸水

 三、实验仪器

电泳仪, PCR仪,高速离心机,移液器,电泳仪,电泳槽,紫外分析仪

 四、操作步骤

1cDNA的合成

逆转录体系的组成:

2PCR扩增特异性片段

25ul PCR体系的组成:

五、实验注意事项

整个操作始终注意避免RNA酶的污染;

PCR反应灵敏,注意避免试剂污染;

酶易失活,整个操作注意在冰上进行。

设立对照:阳性对照:阳性模板,阴性对照:阴性模板,试剂对照:除模板外的所有组分。




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