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原代细胞培养
免疫共沉淀(Co-IP)

时间:2021-03-05 浏览:421次

免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。

其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。

然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。




免疫共沉淀优点
(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
免疫共沉淀缺点
(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;
(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
免疫共沉淀实验流程
(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白免疫共沉淀酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清。
(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜。
(3)取10 μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3 000 rpm离心3 min。
(4)将预处理过的10 μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连。
(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3 000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1 ml 裂解缓冲液洗3~4次;最后加入15 μl 的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟。

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。




注意的问题:
(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。
(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用。
(3)使用对照抗体:
单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体:正常兔IgG
免疫共沉淀注意的问题
(1)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。
(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。


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