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原代细胞培养
细胞凋亡检测

时间:2021-03-05 浏览:366次

细胞凋亡

细胞凋亡或称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death ,PCD)是细胞的生命现象之一,它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关,自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死,它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变,包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserinePS)位于细胞膜的内侧,但在凋亡的细胞,PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KDCa2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素(如FITCPE)或生物素(Biotin)标记,以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。


一、实验步骤:

1.  凋亡细胞的制备

2.  200 μl细胞悬液加入1 mlPBS,轻轻震荡使细胞悬浮,1000 rpm 4 ℃离心10 分钟,弃上清。

3.  重复步骤2两次。

4.  将细胞重悬于200 μl 标记缓冲液。

5.  加入10 μl Annexin V-FITC,轻轻混匀,避光室温反应15 分钟或4 ℃反应30 分钟。

6.  加入300 μl标记缓冲液,立即上机(流式细胞仪)检测。


二、注意事项:

1.  整个操作过程动作要尽量轻柔,切勿用力吹打细胞,尽量在4 ℃下操作。

2.  反应完毕后要尽快检测,因为细胞凋亡是一个动态的过程,反应一小时后荧光强度就开始衰变。

3.  Annexin V-FITC是光敏物质,在操作时要注意避光。


三、实验结果

用荧光显微镜观察,凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。PS转移到细胞膜外不是调亡所特有的,也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI(碘化丙啶)拒染法,用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。


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