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原代细胞培养
细胞周期检测

时间:2021-03-05 浏览:527次

细胞周期

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法等。


一、BrdU

1、原理

BrdU5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdUDNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。

细胞周期(Tc=48/{M1 2M2 3M3 4M4 /100}(小时)

2、仪器、用品与试剂 

2.1、仪器、用品:同常规细胞培养

2.2、试剂:BrdU1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC

3、操作步骤 

3.1、细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使最终浓度为10μg/ml

3.244小时加秋水仙素,使每ml中含0.1μg

3.348小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

3.4、常规染色体制片(见第三部分:染色体技术)。

3.5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC 液,距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。

3.6、弃去2×SSC液,流水冲洗。

3.7Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。

3.8、镜检100个分裂相,计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

3.9、计算:

2×SSC配制: NaCl 1.75克,柠檬酸三钠·2H2 O 0.88克,加水至100ml4℃保存。

附:BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。


二、PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞,弃上清,用预冷PBS洗细胞两次。

2、加入预冷70%乙醇,于4℃固定过夜,或-20℃长期固定(4℃过夜一般隔天就进行检测,如果想推迟几天测,那就保存在-20℃,有资料说-20℃可以保存一个月,个人建议尽量在最短时间内检测,有些实验是在不同时间点上收细胞,这时我就等最后一次固定完了一块测,基本上也多在一周内检测完毕,没有特地去比较保存时间对检测结果的影响)。

3、细胞染色

离心收集细胞,以1mLPBS洗细胞一次,加入500uLPBS50ug/mL溴化乙锭(PI),100ug/mL RNase A0.2% Triton X-1004℃避光孵育30分钟(PI我是直接用PBS配成工作浓度,然后加入细胞沉淀混匀,RNA酶现加,但有时不加发现对实验结果也没太大的影响) 。

4、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2-3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

分析时,使用FL2-wFL2-A显示,去除联体细胞。

细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份,如果有凋亡,在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0),而如果分析时细胞窗口没设置好,可能在最前面还有细胞碎片峰。


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