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原代细胞培养
Western Blot免疫印迹

时间:2019-01-17 浏览:418次

Western Blot免疫印迹


Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

一、 原理
Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 
二、WB技术操作步骤:
1 样品准备
1)分别取大约200mg组织加入液氮碾磨成粉末状,按每200mg组织加900μl上样Buffer(无溴酚蓝)和100ul 10mg/ml PMSF,混匀,玻璃匀浆器冰点匀浆;
2)4℃,12000rpm离心10min;
3)取上清夜-70℃冻存24hr;
4)4℃ 12000rpm再次离心10min,取上清分装,一份用于定蛋白,另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min,后于-20℃保存待用。
2 定蛋白及计算电泳上样量
根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量,电泳上样量定为40ug
3 电泳
1)安装好电泳装置;
2)根据不同的指标配制相应浓度的分离胶,灌胶约3/5体积,液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇);
3)30min后,待凝后倾去封液;
4)配5%的浓缩胶,灌胶至距平板顶部2mm处,插入梳子, 30min后,待凝后拔出梳子,用去离子水清洗加样孔,用滤纸吸干;
5)上样:各样品取50ug上样,marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理);
6)缓慢加入内、外槽缓冲液,接通电源,90v电泳至指示剂进入分离胶后,调电压至150V继续电泳;
7)当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳;
4 转膜及检测
1)准备2个12cm的平面皿,一个装去离子水浸泡NC膜20min,另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min;
2)取下胶,切除浓缩胶部分后,将分离胶浸入转移缓冲液中约5min;
3)按顺序安装好转膜装置(黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板);
4)完全排除气泡, 4℃,100mA转膜2h;
5)倾去转膜缓冲液,拆除转膜装置,将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min,用去离子水清洗至能看到条带,后用铅笔标出marker位置,再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右;
6)将膜转移至另一容器中,用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜;
7)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗;
8)37℃摇床孵育约2h;
9)PBST洗涤4次,每次5min;
10)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗,37℃摇床孵育约30min;
11)PBST洗涤4次,每次5min;
12)将膜转移至尽可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物,室温孵育30min;
13)取出NC膜,用蒸馏水漂洗后晾干;
14)扫描及分析。

三、 注意事项
1、 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2、 显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2

3、 DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。

4、客户要确保检测样本没有问题。

5、客户要确保抗体的有效性。
6、实验周期比较紧张的客户需特别说明。
7、收费标准:以每张膜8个样本收费,不足8个样本的按8个样本收费)

四、麟美生物|WB实验周期:
接受样本后,1-2个月。

五、麟美生物|WB实验注意事项:
1、客户要确保检测样本没有问题。
2、客户要确保抗体的有效性。
3、实验周期比较紧张的客户需特别说明。
4、收费标准:以每张膜8个样本收费,不足8个样本的按8个样本收费)

六、麟美生物|WB服务结果提供:
1、目的蛋白实验图片。
2、灰度分析结果。(免费分析)
3、内参结果。(免费跑胶)
4、详细的实验步骤。

5、免费提供蛋白样本保存液。





结果展示




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